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FSAP | 从孟加拉国牛肉供应链中分离出形成生物膜的大肠杆菌的分子表征

FSAP 动物源食品科学
2024年07月11日 11:39

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锡尔赫特农业大学兽医、动物和生物医学科学系的Sohel Rana等探究大肠杆菌（Escherichia coli）抗菌谱和抗菌素耐药基因（antimicrobial resistance genes，ARGs），为孟加拉国城市环境中错综复杂的食品安全状况提供见解。

Introduction

食源性感染是全球公共卫生的主要危害，特别是在人口密度高的城市。由于这些地区错综复杂的食品供应链和饮食习惯，食源性感染可以通过受污染的肉制品传播。这些病原体使消费者的健康面临严重风险。人口稠密的孟加拉国首都达卡及加济浦尔市的食品安全保障问题，因其快速城市化和人口增长而加剧。

因食用生牛肉和即食（ready-to-eat，RTE）产品，达卡和加济普尔的食源性病原体的存在令人担忧。大肠杆菌是食源性病原体之一，以其诱发不同强度胃肠道疾病的能力而闻名。食源性疾病暴发与受污染的肉制品有关，而肉类制品是病原体传播的主要途径。食物中的大肠杆菌污染对公众健康构成严重危害，并可能导致多种胃肠道症状。

大肠杆菌对抗生素耐药性的发展加剧了这个问题。大肠杆菌菌株中多重耐药性的增加使许多严重感染的治疗复杂化，并构成重大的公共卫生问题。在人类医学和畜牧业中，不恰当和过度使用抗生素进一步增强了病原体的抵抗能力。除了限制可用的治疗方法外，这种现象还引发了对抗生素耐药的基因可能通过食物链从动物传给人类的问题。

大肠杆菌采用多种策略在环境中生存和持续存在，并且有研究记录了不同大肠杆菌病理类型的生物膜形成能力。生物膜是细胞的聚集体，周围环绕着由生物膜内细胞产生的细胞外聚合物基质。生物膜内的细菌对抗生素、杀菌剂和其他致敏剂具有高度耐药性。此外，耐药性通常在引入新抗生素后不久出现，由于技术和财务方面的挑战，开发新的抗生素极为困难。

Results

1 微生物负载和大肠杆菌的发生

2 类样本的微生物负载均超过孟加拉食品安全局（Bangladesh Food Safety Authority，BFSA）规定的微生物污染安全阈值。平均菌落总数显著明显高于BFSA推荐的值（P＜0.001）。在达卡市公司（Dhaka City Corporation，DCC）和加济浦尔市公司（Gazipur City Corporation，GCC）的生牛肉和RTE样品中检出较高的菌落总数。样本上大肠杆菌负载量也显示污染水平较高（P＜0.001）。在样本中，GCC生牛肉的大肠杆菌含量最高。所有样品的微生物负载量均超出BFSA限值。晚间生牛肉样品的细菌数量比早晨样品高7～9 倍。在检查的240 个样本中，86 个样本（36%）的大肠杆菌检测呈阳性。在样本中，来自GCC的生牛肉大肠杆菌含量最高，70%的样本检测呈阳性，而来自GCC的RTE中大肠杆菌检测呈阳性的样本占比最低。

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A.菌落总数；B.大肠杆菌负载；C.不同时间大肠杆菌负载变化；D.大肠杆菌的发生率。***.P＜0.001。
图1  生牛肉和RTE样本中的大肠杆菌情况

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泳道M. 100 bp DNA分子质量标准；泳道NC.对照；泳道1～6.大肠杆菌阳性分离株。
图2  大肠杆菌的分子检测
2 大肠杆菌分离株的抗菌谱

大肠杆菌分离株表现出多种抗生素耐药性模式。氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星和阿奇霉素是耐药性最强的抗生素，分别为100%、81%、71%和67%。在敏感性方面，大肠杆菌分离株主要对万古霉素（64%）、美罗培南（57%）和氨曲南（51%）敏感。此外，大多数分离株对不止一种抗生素类别具有耐药性，表明其具有多重耐药性。

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图3  大肠杆菌分离株的抗菌谱
3 抗生素ARGs

从生牛肉和RTE样品中检出86 个阳性大肠杆菌分离株，检出10 个ARGs。结果表明，发现了几种环境ARGs，其中最常见的ARGs是blaTEM和tetA，分别为72%和65%。此外，blaOXA-1、blaCITM、blaNDM-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M、blaCMY、blaCTX-M-1和blaSHV基因的比例分别为42%、33%、6%、20%、17%、16%、14%和9%。

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A.泳道M.100 bp DNA分子质量标准；泳道NC.对照；泳道1，blaCITM；泳道2. blaSHV；泳道3. blaTEM；泳道4. tetA；泳道5. blaOXA-1；泳道6. blaCMY。B.泳道M. 100 bp DNA 分子质量标准；泳道NC.对照；泳道1. blaNDM-1；泳道2. blaCTX-M；泳道3. blaCTX-M-1；泳道4. blaCTX-M-2。
图4  大肠杆菌分离株抗菌素ARGs的分子检测
4 生物膜形成

在组织培养实验中，62%与刚果红染色结果一致。在中等RTE样品中发现的强生物膜形成大肠杆菌的比例最高（9%），而大多数分离株的生物膜生产率较低。分子检测结果表明，在53 株用于生物膜形成的阳性分离株中，绝大多数含有csgA基因，占96%。此外，观察到fliC（80%）、bcsA（66%）和fimH（60%）的高患病率，表明其在生物膜形成中起重要作用。相比之下，agn43的患病率相对较低，仅30%的分离株携带该基因。

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图5  大肠杆菌生物膜形成

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泳道M. 100 bp DNA分子质量标准；泳道NC.对照；泳道1. bcsA；泳道2. agn43；泳道3. fimH；泳道4. csgA；泳道5. fliC。
图6  大肠杆菌分离株中生物膜调控基因的扩增DNA
Conclusion
该研究结果明确强调了在这种城市背景下与牛肉产品消费相关的公共卫生风险。大肠杆菌等病原体的高流行率表明迫切需要关注整个供应链的食品安全实践和卫生标准。这些病原体之间的多药耐药程度和相关基因的存在进一步凸显了紧迫性，揭示了不负责任的使用抗生素与耐药菌株增殖之间的明显联系。具有生物膜形成能力和相关调控基因的大肠杆菌发生率较高，百分比较高，表明对食品安全和公众健康的极大关注。因此，包括监管机构、食品生产商和消费者在内的利益相关者必须合作并采取果断行动。加强食品安全法规、促进合理使用抗生素、实施严格的卫生习惯以及加强监测机制都是最大限度地减少食源性病原体对公共卫生构成威胁的关键步骤。

Abstract


Escherichia coli is a notorious ubiquitous organism among the foodborne pathogens which can form biofilm leading to the development of antibiotic resistance. We aimed to investigate E. coli isolated from a total of 240 raw beef and ready-to-eat samples obtained from the capital of Bangladesh along with the microbial quality of the samples. The isolates underwent antibiogram profiling in accordance with the Clinical and Laboratory Standards Institute Guideline 2023 and characterized for the presence of antibiotic resistance genes, as well as for phenotypic and genotypic detection of biofilm formation. The average total aerobic counts and specific bacterial counts exceeded the recommended limit by Bangladesh Food Safety Authority. Among the samples, 86 (36%) samples were positive for E. coli. The antibiogram profile depicted diverse resistance patterns with the highest resistance to ampicillin (100%), amoxicillin (81%), ciprofloxacin (71%), and azithromycin (67%). However, vancomycin (64%), meropenem (57%) and aztreonam (51%) were the most sensitive antibiotics to the isolates. The antimicrobial resistance encoding genes blaTEM (72%) and tetA (65%) were the most prevalent where the percentage of blaOXA-1, blaCITM, blaNDM-1, blaCTX-M-2, blaCTX-M, blaCMY, blaCTX-M-1and blaSHV genes were 42%, 33%, 6%, 20%, 17%, 16%, 14% and 9% respectively. Phenotypic characterization, utilizing Congo red agar and microtiter plate tests, identified 53 out of 86 isolates as biofilm producers, with 10 classified as strong producers, and 8 and 35 as intermediate and weak producers, respectively. Molecular detection methods revealed that among the 53 isolates positive for biofilm production, 96% carried the csgA gene. Additionally, high prevalence rates were observed for fliC (80%), bcsA(66%), and fimH (60%), indicating their significant roles in biofilm formation. Conversely, the prevalence of agn43 was lower, with only 30% of isolates harboring this gene. This study addresses a knowledge gap, highlighting the public health risks associated with biofilm-producing foodborne pathogens and the emergence of antimicrobial resistance, underscoring the necessity for improved hygiene practices to mitigate the public health threats posed by these pathogens.





编辑：阎一鸣、林安琪；责任编辑：刘莉




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