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FSHW | 亚麻木酚素大分子结构鉴定及抗氧化活性评价:结构-抗氧化构效关系分析

FSHW 食品科学与人类健康
2025年02月24日 05:51
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文章简介
木酚素是一类重要的植物次生代谢产物,因其潜在的健康益处而受到广泛关注,涉及预防卵巢癌、心血管疾病、氧化应激和炎症等。植物中木酚素的含量通常低于2 mg/100 g,然而亚麻籽Linum usitatissimum L.)中的木脂素高达9~30 mg/g。开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SDG)是亚麻籽中主要的木酚素,通常以聚合物形式存在,称为亚麻籽木酚素大分子(FLM)。研究表明,FLM的抗氧化活性在很大程度上受其结构和组成的影。由于缺乏准确的结构解析,包括多组分的比例、位置和聚合程度,关于其组成、结构和抗氧化活性之间的相关性的信息仍然有限。在本研究中,利用高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-ESI-QTOF-MS/MS)和超高效液相色谱(UPLC)技术对FLM进行了定性和定量分析,进一步通过化学测定(DPPH、ABTS、铁还原抗氧化能力(FRAP))和人肝癌细胞抗氧化活性测定(HepG2-CAA)进一步综合评价FLM的抗氧化活性。结合凝胶层析分离制备不同聚合度的FLM组分,深入分析了FLM抗氧化活性与组成结构之间的关系。

将FLM完全皂化水解后的产物通过UPLC-ESI-MS/MS进行多酚广靶分析,共鉴定出构成FLM的酚类化合物64种,其中木酚素13种,酚酸31种,黄酮8种,黄酮醇12种,香豆素5种。进一步通过半制备RP-HPLC分离制备后使用UPLC-ESI-MS/MS定性鉴定出13种酚类化合物表1)和3种低聚体(表2),结合标准品质谱信息和文献对比确定FLM组成。FLM中主要木酚素为SDG,此外还鉴定出酚酸葡萄糖苷(CouAG、FerAG和咖啡酸等)和其他酚类化合物。通过未完全皂化水解释放的低聚物组成进行分析发现,在二聚体、三聚体中,CouAG通常和SDG同时存在,而FerAG通常和HDG同时出现,因此可推测归纳酚酸连接规律,即SDG与CouAG相连、HDG和FerAG相连。

表1  完全皂化后,UPLC-QTOF-MS/MS表征游离FLM的多酚类成分

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表2  不完全皂化后,UPLC-QTOF-MS/MS对游离FLM多酚类成分的负离子/正离子模式表征

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通过GPC色谱对FLM混合物进行分级,结果表明F1~F8的保留时间发生有规律的延迟现象(图1B),进一步证明了FLM是由不同分子量的链组成的混合物。通过计算获得F1~F8的摩尔比例(图1C),随着保留时间的增加,SDG的相对摩尔比例从32%增加到56%(P<0.05),CouAG的相对摩尔比例从32%降低到12%(P<0.05)。而其他酚类化合物的相对摩尔比在F1~8之间无显著变化进一步计算了CouA与CouAG、ferAG与FerA、PDG与PDM、(+,-)SDG与(-,-)SDG等组分的摩尔比,其中咖啡酸葡萄糖苷(CarfG)和(-,-)SDG的摩尔浓度计算以Carf或(+,-)SDG相对摩尔浓度计算。根据上述结果很容易证明SDG和CouAG是FLM的主要成分,且SDG是FLM的骨架的主要组分。此外结合图1D结果发现CouAG + CouA的摩尔比例与SDG比例随着FLM分子量增加而降低,表明FLM链长越长CouAG占比越低,这说明CouAG最可能可能位于FLM的尾端并控制FLM合成过程中的链延长。

图片图1  (A)半制备反相高效液相色谱法制备FLM的F1~F8;(B)UPLC对F1-F8的再检测;(C)F1~F8中酚类化合物的摩尔比;(D)不同组分主要酚类化合物摩尔比的比较;(E)根据不同组分中酚类化合物的摩尔比从亚麻籽壳中提取的木脂素大分子示意图

通过化学法DPPH、ABTS•+自由基清除活性、FRAP等多个评价指标对FLM抗氧化活性进行了深入分析。图2A-B为FLM清除DPPH、ABTS•+自由基的活性能力,在相同浓度范围内,FLM、SDG和SECO清除DPPH自由基能力的EC50值分别为284.77、40.71和20.21 μg/mL,对ABTS•+自由基活性清除能力EC50值分别为510.67、103.44和37.05 μg/mL。当三者浓度为50 μg/mL时,FLM、SDG和SECO的FRAP值分别为18.1、100.6和158.4 μg TE/mL。以上结果表明,以上三种形态木酚素的抗氧化能力大小为:FLM < SDG < SECO。细胞抗氧化实验表明,添加FLM和DCFH的HepG2细胞未经PBS冲洗时,FLM的EC50值为(644.22 ± 3.88)μg/mL。由此可知,FLM在HepG2中可通过破坏过氧自由基链式反应降低DCFH诱导的细胞氧化应。但经PBS冲洗后,FLM的EC50显著降低(P<0.05),表明去除HepG2细胞膜和细胞外的FLM后,FLM对过氧诱导氧化应激的抑制作用显著降低。该结果证明FLM主要位于HepG2细胞膜表面和膜外破坏过氧自由基链式反应,从而达到抑制细胞氧化的效果。

图片图2  FLM及其结构单元SDG和SECO的抗氧化活性

最后,对分离的各馏分抗氧化能力与其组成成分相关性分,分析结果表明SDG、HDG和PDG(PMG)的浓度和各馏分的抗氧化特性(DPPH和ABTS自由基清楚能力)呈正相关,其他酚酸类化合物对FLM各馏分的抗氧化特性无显著相关性。也意味着FLM组成、分子量和链长都是影响其抗氧化活性的主要因素。FLM的抗氧化活性与组成结构相关性存在如下相关性:1)随着链长增加,FLM的抗氧化活性增加;2)HDG和/或PDG是测定FLM抗氧化活性的关键多酚;3)由于苯酚羟基暴露有限,SDG对FLM抗氧化活性的提高影响有限;4)FerAG可能会基于葡萄糖苷的空间位阻作用而限制FLM对自由基的清除作用,导致FLM的抗氧化活性降低。



第一作者
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程晨,武汉轻工大学讲师,研究领域:食品营养与安全,活性成分稳态化递送研究。主持国家自然科学基金1项,以第一作者在Food Chemistry、JAFC、FSHW、FOOD & FUNCTION等食品科技领域国际顶尖杂志发表SCI论文6篇,中文核心3篇,科研成果申请国内外专利1项。针对我国n-3 PUFA生物利用率低、稳定性差等产业问题,构建了高效亚麻籽油乳液递送体系,通过引入亚麻木酚素提升了必需脂肪酸ALA体内外稳定性及消化吸收特性,实现了亚麻籽的高值化利,丰富了乳液界面PUFAs氧化和多酚类物质体内胶束化吸收理论,并为基于“全摄入链式调控”实现植物来源ALA高效摄入及转化提供理论依据。






通信作者
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邓乾春,博士,研究员,博士生导师,全国人大代表,民革中央委员,民革湖北省委会副主委,国家特色油料产业技术体系岗位科学家,中国农业科学院“农科英才领军人才”,中国农业科学院油料作物研究所副所长、油料品质化学与加工利用创新团队常务执行首席,农业农村部油料加工重点实验室副主任,国家健康油脂产业技术创新联盟秘书长。入选中组部“国家万人计划科技领军人才”、科技部“创新人才推进计划中青年科技创新领军人才”、农业农村部“神农青年英才”。现任湖北省食品科学技术学会副理事长、中国人体健康科技促进会临床营养专委会副主任委员,《Food Science and Human Wellness》、《Critical Reviews in Food Science and Nutrition》编委,《中国油料作物学报》副主编,《食品科学》、《轻工学报》编委。主要从事特色油料加工与营养学研究,先后主持国家重点研发计划项目、国家自然科学基金、湖北省重点研发计划、新疆自治区重大科技专项课题、武汉市应用基础前沿项目、产学研合作课题等20余项,重点以亚麻籽、核桃、油茶、芝麻、紫苏、火麻仁、沙棘等特色油料为研究对象,开展全组分提质加工和产业化应用研究,创制了适于不同人群的国产保健食品、植物乳、营养健康油脂等新产品20余个,获授权国家发明专利30余件,以第一作者、通讯作者在《Prog. Lipid Res.》、《Compr. Rev. Food Sci. Food Saf.》、《Food Hydrocoll》、《Food Chem.》、《食品科学》等国内外期刊发表收录论文100余篇,以第二完成人获得国家科技进步二等奖、省部级一等奖等科技奖励3项。


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许淑芳,医学博士,主任医师,营养学博士后,中国营养学会首批注册营养师。原武汉市中心医院临床营养科主任,现深圳前海泰康医院临床营养科主任。中国抗癌协会肿瘤营养分会常务委员兼副秘书长、中国食品科技学会医学食品分会秘书长、中国营养学会临床营养专业委员会委员、中国营养学会肿瘤营养分会常务委员、中华医学会肠外肠内营养学分会肾病学组委员、中国老年学和老年医学学会营养食品分会常务委员等。国内外公开发表论文二十余篇,SCI论文十余篇,主持及参与国家自然科学基金项目3项,横向课题十余项。作为副主编、编委等参编《临床营养学》、《营养免疫学》、《营养与临床》、《肿瘤微生态学》等6部教材、专著。参与2022年《肿瘤患者特殊医学用途配方食品使用指南》、2023年《营养疗法CACA指南》、2023《血脂异常医学营养管理专家共识》、2024《老年肌肉减少症患者筛查诊断与营养干预指南》等编写。荣获“全国肿瘤营养青年精英奖”、“全国肿瘤营养先进个人”、“全国临床营养优秀青年”、“湖北省营养学会优秀个人” 等多项荣誉。






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Structural identification and antioxidative activity evaluation of flaxseed lignan macromolecules: structure-activity correlation


Chen Chenga,1, Lei Wanga,1, Xiao Yua,b, Fenghong Huanga, Jing Yanga, Fang Gengc, Xiaoyang Xiaa, Xia Xianga, Shufang Xud,*, Qianchun Denga,*

a Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Oil Crops and Lipids Process Technology National & Local Joint Engineering Laboratory, Hubei Key Laboratory of Lipid Chemistry and Nutrition, and Key Laboratory of Oilseeds Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062, China

b College of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China

Key Laboratory of Coarse Cereal Processing (Ministry of Agriculture and Rural Affairs), School of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China

d Clinical Nutrition Department, the Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Flaxseed lignan macromolecules (FLM) are a class of important secondary metabolites in flaxseed, which have been widely concerned due to their biological and pharmacological properties, especially for their antioxidative activity. For the composition and structure of FLM, our results confirmed that ferulic acid glycoside (FerAG) was directly ester-linked with herbacetin diglucoside (HDG) or pinoresinol diglucoside (PDG), which might determine the beginning of FLM biosynthesis. Additionally, p-coumaric acid glycoside (CouAG) might determine the end of chain extension during FLM synthesis in flaxseed. FLM exhibited higher antioxidative activity in polar systems, as shown by its superior 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging capacity compared to the 2,2’-azinobis(3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid) (ABTS) cation free radical scavenging capacity in non-polar systems. Moreover, the antioxidative activity of FLM was found to be highly dependent on its composition and structure. In particular, it was positively correlated with the number of phenolic hydroxyl groups (longer FLM chains) and inversely related to the steric hindrance at the ends (lower levels of FerAG and CouAG). These findings verified the potential application of FLM in non-polar systems, particularly in functional food emulsions.  

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Reference:

LU Y S, QIN R B, WANG J, et al. The impact of the novel starch-lipid complexes on the glucolipids metabolism, inflammation, and gut dysbiosis of type 2 diabetes mellitus rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3210-3223. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250008.

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本文编译内容由作者提供
编辑:梁安琪;责任编辑:孙勇
封面图片:图虫创意




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